【簡(jiǎn)介】

2．1菌種來(lái)源

    自然環(huán)境中，能夠降解石油成分的微生物多達(dá)200種以上。其中，假單胞菌屬、棒桿菌屬、微球菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬中存在許多高效降解石油成分的細(xì)菌菌株^[2-3]。本試驗(yàn)從各種石油污染的環(huán)境中采集菌種樣品，作為富集馴化的菌源：(1)以威海槐云路五菱汽車修配廠廢機(jī)油、汽油、柴油污染的土壤為樣品1；(2)以威海東方大眾汽配廠受油污污染的土壤為樣品2；(3)以威海宇成線業(yè)有限公司污水排放口的土壤為樣品3；(4)以電鍍廠廢油污染的土壤為樣品4。

2．2培養(yǎng)基

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定和微生物分離，原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基用于原油降解菌平板數(shù)量的測(cè)定。原油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(pH=7．2)的成分如下(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示)：潤(rùn)滑油0．2‰NaCl 0．5‰(NH₄)₂S0₄0．1％，MgS0₄·7H₂0 0．025％，NaN0₃ 0．2％，KH₂P0₄0．5％，K₂HP0₄·H₂0 1．0％，瓊脂l．6％。

2．3試劑和儀器

    所用石油醚等試劑均為市售分析純。

    恒溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；pH／溫度測(cè)試筆，意大利哈鈉公司；紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)、分析天平和可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密儀器有限公司；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

2．4富集馴化處理

各稱取1～4號(hào)樣品200 g，分別加入蒸餾水800 mL，攪拌30 min，靜置沉淀，上清液轉(zhuǎn)移到l0 L的玻璃瓶中，從而獲得多種來(lái)源的混合菌種。然后，加入土壤浸提液1L[1 L水中加入200 g肥沃土壤(提供各種元素)，攪拌，沉淀，獲得的上清液為土壤浸提液]，控制溫度在35 ℃、pH 8．5，曝氣富集馴化數(shù)天?；旌弦浩貧怦Z化l d后測(cè)定殘油含量，然后定量補(bǔ)充潤(rùn)滑油、無(wú)機(jī)磷和無(wú)機(jī)氮等元素，調(diào)整混合液中碳、氮、磷的比例，以利于微生物的生長(zhǎng)。富集馴化液中C(即7樣機(jī)油，為馴化液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的l％)、N[即(NH₄)₂S0₄]和 P(即KH₂P0₄)的質(zhì)量比約為l00：5：1。除油微生物馴化裝置如圖l所示。

圖1除油微生物富集馴化裝置

Figure l Device for enrichment and domestication of microbes

2．5測(cè)定指標(biāo)

    石油含量的測(cè)定采用紫外分光光度法，混合液中油的提取方法如下：將定量的待測(cè)樣品移入250 mL分液漏斗中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％的硫酸5 mL酸化，按混合液質(zhì)量的2％加入氯化鈉，用20 mL石油醚清洗采樣器皿，移入分液漏斗，萃取，油層移入100 mL容量瓶中。萃取完全后，用石油醚稀釋至標(biāo)線。在選定波長(zhǎng)處，用10 min石英比色皿、以石油醚為空白試樣測(cè)量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出石油的含量。

2．6馴化過(guò)程中微生物的變化

    馴化的初期和末期，分別利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和原油培養(yǎng)基、采用MPN(Maximum Probable Number)法測(cè)定異養(yǎng)細(xì)菌和原油降解菌的數(shù)目，在30 ℃下，分別培養(yǎng)l周和2周^[2]，然后統(tǒng)計(jì)細(xì)菌的數(shù)目。利用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基分別對(duì)馴化前、后的微生物進(jìn)行分離，在30 ℃下培養(yǎng)3 d，觀察平板分離的菌株，將菌落形態(tài)和菌體形態(tài)一致的菌落作為純種予以保留。

2．7正交試驗(yàn)因素水平

在馴化的末期，以馴化液和分離的菌種混合液制作的混合菌液進(jìn)行正交試驗(yàn)^[5]，按L₉(3⁴)考察接種量、初始pH、溫度和加油量對(duì)降解率的影響。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。在300 mL的三角瓶中，按正交表設(shè)定裝入混合菌液，不足的部分以無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基補(bǔ)足，液體總體積為100 mL。在30 ℃、150 r／min的搖床中培養(yǎng)24 h后，利用紫外分光光度法測(cè)定殘油的含量。

表1正交試驗(yàn)因素水平表

Table1  Factors and levels of orthogonal test

2．8金屬表面除油效果試驗(yàn)

    以硫酸銅浸漬法考察金屬表面的除油效果[4]。將清洗后的工件浸在酸性硫酸銅水溶液(其組成為質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％的CuS0₄和2％的H₂S0₄)中，l min后取出工件，用水沖洗。根據(jù)銅膜情況評(píng)定清潔度，若銅膜完整均勻、光澤及結(jié)合力好，表明工件表面無(wú)油污；反之，工件表面有油污。